Afloramiento de algas en aguas continentales

Las cianobacterias (algas verde-azuladas) son procariotas unicelulares que crecen y se desarrollan principalmente en aguas continentales. Son organismos autótrofos que realizan fotosíntesis oxigénica y que tienen una participación esencial en la cadena alimentaria de diversos ecosistemas. Sin embargo, bajo determinadas circunstancias (eutrofización, cambio climático, etc.) son capaces de crecer de forma descontrolada dando lugar a” blooms” o afloramientos.

Afloramiento de cianobacterias en el lago Santa Claire en Estados Unidos. El afloramiento de las cianobacterias puede llegar a ser observable incluso desde el espacio. http://earthobservatory.nasa.gov/NaturalHazards/view.php?id=86327&src=twitter-nh&linkId=16012048

Peligrosidad por liberación de toxinas

La peligrosidad de estos afloramientos de cianobacterias radica en la capacidad que tienen ciertos géneros de producir toxinas patógenas para el ser humano. La toxina más común y peligrosa es la microcistina, la cual es producida por los géneros Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Nostoc y Anabaenopsis. Se estima que alrededor de un 50% de los afloramientos son tóxicos.

Las microcistinas son metabolitos secundarios que normalmente se encuentran en el interior de la célula. Sin embargo, cuando la toxina es liberada, normalmente por lisis celular, el agua queda contaminada y su consumo es nocivo no solo para el ser humano si no también para los animales. Un factor a tener en cuenta cuando se analizan estas toxinas es que la ausencia de microcistinas libres no indica la ausencia del microorganismo en el agua y por tanto los tratamientos de potabilización podrían provocar la rotura de las células y su liberación en el agua de consumo. Por lo tanto, un control del agua potabilizada parece aconsejable o incluso, mejor todavía, se podría proceder al análisis de microcistinas intracelulares como paso previo a la potabilización y tratamiento del agua.

En los últimos años la preocupación por las cianotoxinas no se ha limitado exclusivamente al consumo del agua ni a su contacto por un uso recreacional, sino también por la ingesta de alimentos que han estado expuestos a la toxina como las hortalizas y sobretodo los pescados y los moluscos, los cuales tienen una elevada capacidad de bio-concentrar las toxinas. Hasta hace poco las microcistinas se asociaban exclusivamente con hábitats de agua dulce. Sin embargo, estas toxinas son muy estables y persistentes y pueden aparecer en ecosistemas marítimos (especialmente en zonas de estuario) procedentes de los de agua dulce que han sufrido alguna floración. Varios estudios han demostrado la acumulación de microcistinas en moluscos bivalvos destinados a consumo humano.

Microcistinas

Las microcistinas tienen carácter hepatotóxico y como se ha constatado en diferentes modelos animales, su exposición continuada tiene un efecto carcinogénico directo sobre el hígado. Son potentes inhibidores de las serin/treonin fosfatasas tipo 1 y 2A de mamífero, las cuales parecen tener una función supresora de tumores. Una vez acumulada la toxina en el hígado, promueven la desorganización del citoesqueleto, peroxidación de lípidos, pérdida de la integridad de la membrana plasmática, fragmentación del DNA, apoptosis y finalmente necrosis.

A nivel estructural, las microcistinas son heptapéptidos cíclicos compuestos por aminoácidos naturales y no naturales. Son muy estables y termorresistentes existiendo más de 100 variedades distintas. Cuatro de ellas (LR, RR, LA y YR) son especialmente frecuentes por lo que la OMS recomienda el consumo seguro de agua con cantidades inferiores a 1 µg/L de microcistina LR.

Estructura molecular de las principales microcistinas. Las microcistinas son heptapéptido cílico formados por amino ácidos naturales y no naturales. Los diferentes amino ácidos presentes en la posición X e Y son los responsables de la existencia de hasta 100 variantes de microcistinas.

Factores que promueven la liberación de toxina

El desarrollo de las cianobacterias está asociado a altas concentraciones de nutrientes siendo el fósforo el nutriente clave que controla la proliferación. La disponibilidad de nitrógeno es también importante en aquellas especies que no son capaces de fijarlo. El aumento de la temperatura, el aumento de la luminosidad o la baja turbulencia del agua son factores que también favorecen su crecimiento.

El afloramiento de especies productoras de toxinas puede transcurrir sin la síntesis y liberación de las mencionadas toxinas. Una de las razones es que dentro de un mismo afloramiento suelen coexistir cepas tóxicas, que contienen todos los genes necesarios para la síntesis de la toxina, y cepas no tóxicas. Esta proporción de cepas tóxicas y no tóxicas puede variar significativamente en el espacio y en el tiempo. Los factores medioambientales que son capaces de modificar esta proporción no están del todo claros.

Además, la presencia de cepas tóxicas no implica necesariamente que la toxina esté siendo sintetizada. A día de hoy se han realizado diversos estudios que han intentado correlacionar la síntesis de toxina con diferentes parámetros físico-químicos (profundidad del lago, temperatura, nutrientes, etc.) y biológicos (cantidad de genes relacionados con la síntesis de las toxinas, cantidad de clorofila, biomasa, etc.). Sin embargo, no se ha podido determinar de forma absoluta ningún tipo de correlación por lo que el único método fiable consiste en el análisis directo de la toxina.

Detección de las toxinas

Se han descrito varias metodologías para el análisis de microcistinas en agua que están basadas en diferentes principios. La utilización de una u otra metodología está vinculada al uso que se va a hacer de los resultados analíticos. En la siguiente tabla se resumen las principales características de las metodologías utilizadas en el análisis de microcistinas.

Principales métodos utilizados para la detección de microcistinas

Desde el punto de vista de su aplicabilidad, se pueden agrupar en dos tipos de métodos que no son excluyentes sino complementarios. Por una parte están los métodos de cribado o “screening” y por otro los métodos de confirmación. Entre los primeros podemos encontrar el bioensayo en ratón, el ELISA y el método de inhibición de la fosfatasa. Como premisa, los métodos de cribado deben ser suficientemente sensibles para evitar resultados falsos-negativos, además, deben ser sencillos y rápidos, y permitir el análisis de un número elevado de muestras.

Por su parte, los métodos de confirmación son aquellos que permiten una identificación inequívoca del analito, entre estos encontramos los métodos instrumentales como HPLC y LC-MS. Los métodos instrumentales tienen como principal desventaja que requieren de la existencia de patrones para cada molécula a ser identificada de forma inequívoca y esto no siempre es posible, especialmente en el caso de las microcistinas (existen más de 100 variantes identificadas).

Por otra parte, los métodos para la detección de las microcistinas pueden clasificarse también como métodos estructurales y métodos funcionales: los primeros se basan en las propiedades físico-químicas de la molécula y entre ellos están el HPLC y los métodos inmunoquímicos, mientras que los segundos utilizan la diana biológica sobre la que actúa la toxina, en este caso la fosfatasa PP1 y PP2A, y por lo tanto, son una indicación del potencial toxigénico de la molécula. Entre ellos están el método de inhibición de la fosfatasa y el bioensayo en ratón.

En cualquier caso, está claro que ambas estrategias son perfectamente complementarias, permitiendo un cribado inicial de las muestras mediante un método rápido y a poder ser basado en el potencial toxigénico, es decir, en una detección proporcional a la toxicidad de la molécula y no a sus propiedades estructurales. Aquellas muestras cuyo resultado ha sido positivo al test de cribado biológico, pueden ser posteriormente analizadas para la identificación de las microcistinas responsables de la contaminación del agua mediante un método instrumental. En algunos casos muestras positivas en la etapa de cribado pueden no ser confirmadas con el método instrumental debido al problema, anteriormente mencionado, de la ausencia de patrones de referencia para muchas de las microcistinas descubiertas hasta el momento.

Otro factor a tener en cuenta durante el análisis de microcistinas en agua es que éstas se pueden encontrar intracelularmente y deben ser liberadas previamente a su análisis mediante un procedimiento adecuado. En la literatura científica se pueden encontrar muchos protocolos de lisis y extracción de las toxinas. Sin embargo, muchos de ellos no han sido perfectamente evaluados en cuanto a su capacidad de recuperación y por lo tanto su aplicación puede generar una infraestimación del contenido en toxinas que puede poner en riesgo la salubridad del agua. Además, el método de extracción debe ser compatible con la técnica de análisis empleada.

Microcystest

Microcystest es un test enzimático simple y rápido para la detección de microcistinas y nodularinas en agua de consumo y de recreo. La toxicidad de las microcistinas está asociada a la inhibición de la fosfatasa 1 y 2A (PP1 y PP2A). Microcystest se basa en la propiedad de inhibición de la fosfatasa para la determinación de la concentración de microcistina en placa microtiter. La enzima hidroliza un sustrato específico y el producto que se genera pueda medirse fotométricamente a 405 nm. Debido a que la capacidad de hidrolizar el sustrato por parte de la fosfatasa depende de la presencia de microcistinas en la muestra, la concentración de toxina puede ser calculada usando una curva estándar.

Microcystest es el primer y único kit comercial disponible basado en la inhibición de la PP2A por las microcistinas, y por lo tanto es capaz de detectar todas las microcistinas potencialmente tóxicas. La Agencia Americana de Protección del Medioambiente (EPA) ha verificado el adecuado funcionamiento de Microcystest para la detección de microcistinas a través del programa tecnológico de verificación ambiental (ETV).